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本试剂盒是用EGFP标记的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生。试剂盒中还提供了碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。本试剂盒适合使用流式细胞仪和荧光显微镜进行检测。

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ(膜联蛋白-V)是一种分子量为35～36kDa的Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI则被排除在活细胞(Annexin V-/PI-)和早期凋亡细胞(Annexin V+/PI-)之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被EGFP和PI结合染色呈现双阳性(Annexin V+/PI+)。

组分	20T	50T	100T
Annexin V-EGFP	0.1mL	0.25mL	0.5mL
PI Staining Solution	0.2mL	0.5mL	1mL
1×Binding Buffer	10mL	25mL	50mL

保存：-20℃，避光，避免反复冻融，有效期2年。

• 由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。
  
• 如果需要在短时间内多次重复使用，可以在4℃避光保存，半年有效。
  
• 对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-EGFP的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。
  
• 实验中如需要固定细胞，比如在检测凋亡的同时检测细胞周期，只能选用Annexin V-FITC，而不能选用Annexin V-EGFP，因为在固定过程中EGFP会变性导致丧失激发荧光的能力。固定前需要先将细胞与Annexin V-FITC进行孵育，并用Binding Buffer洗掉未结合的Annexin V-FITC。因为固定过程中细胞通透性增加会产生细胞碎片，可以和Annexin V结合，对结果产生干扰。
  
• 如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200g离心洗去血小板。
  
• 试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• Annexin V-EGFP和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。
  
• 本制品仅作科研用途！

• 实验设计
  
  • 空白管：阴性对照细胞，不加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution，用于调节电压。
    
  • 单染管：阳性对照细胞，只加Annexin V-EGFP，用于调节补偿。
    
  • 检测管：处理的细胞，加Annexin V-EGFP和PI Staining Solution。利用空白管和单染管调节好的参数进行实验数据的获得。
• 样品染色
  
  • 细胞收集：
    
    • 悬浮细胞：300g，4℃离心5min收集细胞；
      
    • 贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性；
  • 用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min；
    
  • 用1×Binding Buffer重新悬浮细胞，调节其浓度为1～5×10⁶/mL；
    
  • 取100μL的细胞悬液于5mL的流式管中，加入5μL Annexin V-EGFP，混匀后于室温避光孵育5min；
    
  • 加入10μL PI Staining Solution，并加400μL PBS，立刻进行流式检测。
    注：用流式检测凋亡时，PI受时间的影响很大，时间过长会导致PI的染色增加，所以需要在1h内完成流式检测。
• 流式细胞仪分析
  EGFP最大激发波长为488nm，最大发射波长为507nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535nm，最大发射波长为615nm。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图(two-color dot plot)，EGFP为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10,000 events。典型的实验中，细胞可以分成三个亚群，活细胞仅有很低强度的背景荧光，早期凋亡细胞仅有较强的绿色荧光，晚期凋亡细胞有绿色和红色荧光双重染色。

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